TEAD1 Palmitoylation
VT103 HCL targets TEAD1 (TEA domain transcription factor 1) protein auto-palmitoylation. It inhibits the palmitoylation of TEAD1, thereby blocking YAP/TAZ-TEAD-promoted gene transcription. This compound acts on the Hippo-YAP pathway, which is frequently dysregulated in malignant mesothelioma and other YAP-driven cancers. VT103 HCL selectively targets TEAD1 without preventing palmitoylation of TEAD2, TEAD3, or TEAD4.

由于VT103盐酸盐（HEK293T细胞；3 μM）不抑制TEAD2、TEAD3或TEAD4的棕榈酰化，因此它似乎对TEAD1具有选择性。VT103盐酸盐（NF2缺陷型NCI-H226细胞；3 mmol/L；4或24小时）特异性地破坏了YAP-TEAD1连接[1]。VT103盐酸盐处理后，非棕榈酰化TEAD1水平升高，而棕榈酰化TEAD1水平降低[1]。在YAP报告基因实验中，VT103盐酸盐的IC50值为1.02 nM，证实了其作用[1]。与 VT103 盐酸盐共孵育后，TEAD1 的熔解温度升高幅度最大，达到 8.3°C，高于 TEAD 家族的其他成员。热变性曲线清晰地显示了两个独立的峰，TEAD1 单独存在时（红色曲线）和 TEAD1+VT103 盐酸盐存在时（蓝色曲线）均呈现两个峰，而其他 TEAD 蛋白在有无 VT103 盐酸盐存在下的曲线峰则基本重叠（图 4A，上图）。这与功能性棕榈酰化实验的结果一致，即 VT103 盐酸盐是 TEAD1 的选择性抑制剂。另一方面，经 TEAD 棕榈酰化实验证实为泛 TEAD 抑制剂的 VT107，显著改变了所有四个 TEAD 家族成员的熔解温度（图 4A）。 VT104 改变了所有四种 TEAD 家族成员的熔解温度，但对 TEAD1 和 TEAD3 的改变更为显著。VT106 对所有四种 TEAD 的熔解温度仅有微弱的改变。[1]

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为了确定我们优化的化合物是否以 TEAD 选择性的方式阻止细胞内 YAP/TAZ 与 TEAD 蛋白的相互作用，我们用 VT103 盐酸盐或 VT107 处理 NF2 突变体 NCI-H2373 细胞 4 小时或 24 小时，分别使用 TEAD1 特异性抗体和 TEAD4 特异性抗体免疫沉淀内源性 TEAD1 和 TEAD4 蛋白（图 5A 和 B），并用抗 YAP 和抗 TAZ 抗体检测免疫复合物。与 VT103 盐酸盐选择性结合 TEAD1 蛋白并选择性抑制 TEAD1 棕榈酰化一致，VT103 盐酸盐在处理 4 小时和 24 小时后均能降低 YAP 与 TEAD1 的相互作用，但对 YAP 与 TEAD4 的相互作用无影响。VT103 盐酸盐处理 4 小时即可破坏 TAZ 与 TEAD1 的相互作用。相反，VT107 可阻断 YAP 和 TAZ 与 TEAD1 和 TEAD4 的相互作用，且 24 小时处理的效果强于 4 小时处理（图 5A 和 5B）。活性较低的对映体 VT106 未能阻断 YAP/TAZ 与 TEAD4 的相互作用（图 5B），且在处理 24 小时后仅能微弱地破坏 YAP/TAZ 与 TEAD1 的相互作用（图 5A）。 VT103 盐酸盐在 NF2 缺陷型 NCI-H226 细胞中经 4 小时和 24 小时处理后，也能选择性地破坏 YAP-TEAD1 相互作用（图 5C 和 D）[1]。体外实验表明，VT103 HCL 对 TEAD1 具有强效的选择性抑制作用，在 YAP 报告基因检测中 IC50 值为 1.02 nM。它能特异性地破坏 NF2 缺陷型 NCI-H226 细胞中的 YAP-TEAD1 连接。VT103 HCL 处理导致棕榈酰化 TEAD1 减少，同时非棕榈酰化 TEAD1 增加。热迁移实验表明，与其他 TEAD 家族成员相比，TEAD1 与 VT103 HCL 共孵育后，其熔解温度升高幅度最大（升高 8.3°C）。

VT103 盐酸盐（0.3~10 mg/kg；每日口服一次）即使在 0.3 mg/kg 的剂量下也能降低肿瘤生长 [1]。 VT103盐酸盐在小鼠体内的药代动力学[1] 剂量 静脉注射 口服 7 mg/kg 半衰期（小时） 稳态分布容积（L/kg） 浓度指数（mL/min/kg） 0-24小时曲线下面积（μg*h/mL） 0-24小时曲线下面积（μg*h/mL） 口服生物利用度（%） 峰浓度（ng/mL） 24小时峰浓度（ng/mL） 13.2 4.5 4.7 20.0 14.9 75 896（1小时） 340。VT103盐酸盐和VT104可抑制NF2缺陷型间皮瘤异种移植瘤的生长[1]
VT103盐酸盐在小鼠体内具有优异的口服生物利用度（≥75%）和较长的半衰期（>12小时）（图2）， VT104 使我们能够在人间皮瘤异种移植模型中评估 TEAD 自棕榈酰化抑制的靶点结合和抗肿瘤疗效。如图 6B 所示，在第三次给药后 4 小时，VT103 盐酸盐以剂量依赖的方式显著下调了小鼠 NF2 缺陷型 NCI-H226 肿瘤中 Hippo 通路靶基因 CTGF 和 CYR61 的表达。在同一 NCI-H226 荷瘤小鼠中，VT103 盐酸盐也以剂量依赖的方式下调了肾脏和肝脏中的靶基因表达（补充图 S6A）。然而，在同一时间点，肾脏和肝脏的 H&E 染色图像显示载体组和药物治疗组之间没有差异（补充图 S6B），因此似乎没有观察到任何病理效应。生物分析显示，VT103盐酸盐在循环系统和肿瘤组织中的暴露量均呈剂量依赖性（补充图S6C）。此外，在同一动物体内，肿瘤组织中的化合物积累量似乎高于循环系统（补充图S6C）。通过免疫组化（IHC）检测VT103盐酸盐处理的NCI-H226肿瘤组织中YAP和TEAD1蛋白的表达，结果表明这些蛋白的细胞定位或表达水平没有变化（补充图S6D）。VT103盐酸盐以剂量依赖的方式显著抑制小鼠NCI-H226肿瘤的生长（图6C）。将荷NCI-H226肿瘤的小鼠随机分组，当肿瘤体积达到约110 mm³时，开始每日口服VT103盐酸盐。末次给药于第45天进行。血浆样本于第46天采集。生物分析显示，循环药物浓度呈剂量依赖性（补充图S6E）。在NCI-H226 CDX模型中，每日一次口服3 mg/kg的VT103盐酸盐表现出显著的抗肿瘤疗效，可导致肿瘤消退（第46天时肿瘤生长抑制率TGI = 106.14%，P < 0.001）。每日一次分别以1 mg/kg和0.3 mg/kg的剂量给药时，VT103盐酸盐也显著抑制了肿瘤生长（TGI分别为83.79%，P < 0.001和47.95%，P = 0.001）。在长期每日服用VT103盐酸盐的治疗过程中，未观察到对体重的不良影响（图6C）。

NCI-H2373是一种人类间皮瘤细胞系，其NF2基因存在纯合缺失。尽管该细胞系在小鼠体内肿瘤生长不佳（补充图S7及下文详述），但我们仍利用该细胞系在第二个人类间皮瘤模型中进行了短期药物治疗，以评估VT103盐酸盐的靶点结合情况及其对通路靶基因表达的影响。将亲代NCI-H2373细胞皮下注射到小鼠体内，当肿瘤体积达到约300 mm³时，小鼠接受VT103盐酸盐口服治疗，剂量为10 mg/kg，每日一次，连续3天。对接受 VT103 盐酸盐治疗的 NCI-H2373 肿瘤小鼠在第三次给药后 4 小时采集的肿瘤进行 APEGS 检测分析表明，VT103 盐酸盐使脂质修饰形式的 TEAD1 相对于总 TEAD1 的水平降低了 40.0±0.06%（图 6D；补充图 S8）。在这些 NCI-H2373 肿瘤中，观察到 CTGF 基因表达下调 5 倍（图 6E；本模型研究中未检测 CYR61 的表达）。

虽然在小鼠皮下注射 NCI-H2373 细胞后第 7 天观察到可测量的肿瘤，但这些肿瘤在接下来的 4 周内生长非常缓慢，并且在此期间部分肿瘤出现消退（补充图 S7）。因此，尽管该模型足以进行短期药效学研究，但并非药物疗效研究的理想模型。为了获得第二个可用于评估长期抗肿瘤疗效的体内模型，我们对小鼠体内的NCI-H2373肿瘤进行了连续传代，并获得了NCI-H2373-Tu-P2细胞系。该细胞系经STR鉴定证实与NCI-H2373具有遗传相关性，并通过体外细胞增殖实验证实其对我们的TEAD抑制剂敏感。在第二个人类间皮瘤CDX模型NCI-H2373-Tu-P2中，我们也观察到，当每日一次口服10、3和1 mg/kg的VT103盐酸盐时，肿瘤显著消退（TGI分别为126.70%、118.32%和110.51%；P值分别为0.018、0.022和0.030；图6F）。即使在0.3 mg/kg的剂量下，VT103盐酸盐也能抑制体内肿瘤生长，尽管未达到统计学显著性（TGI值为76.43%，P = 0.124）。所有四个剂量组的VT103盐酸盐动物均未出现体重减轻（图6F）。鉴于在体内培养NF2突变型间皮瘤肿瘤的难度，我们在模型最终失效前重复了两次疗效研究。结果表明，VT103盐酸盐在耐受剂量下具有很高的体内活性，值得进一步评估。

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体内实验表明，VT103 HCL通过抑制皮下肿瘤异种移植瘤的生长而表现出抗肿瘤活性。作为一种口服活性化合物，它具有优异的口服生物利用度和药代动力学特性，能够在体内有效靶向作用。该化合物选择性抑制NF2缺陷型间皮瘤细胞增殖的能力转化为体内疗效，在临床前模型中抑制肿瘤生长。这些发现验证了靶向TEAD1棕榈酰化在YAP驱动型癌症中的治疗潜力。

无细胞TEAD棕榈酰化测定[1]
首先将纯化的重组TEAD1-YBD与化合物孵育，然后与2 μmol/L炔基棕榈酰辅酶A孵育。反应用1% SDS终止，随后按照先前描述的方法进行生物素-叠氮化物点击化学反应。在一些实验中，APCoA的添加浓度和顺序有所不同。分别通过链霉亲和素-HRP和抗TEAD1抗体（Abcam）免疫印迹法检测棕榈酰化TEAD和总TEAD蛋白。

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体外酶/受体结合测定VT103 HCL通常采用生化技术来测量TEAD1棕榈酰化的抑制情况。这些测定使用纯化的TEAD蛋白，并通过酰基-生物素交换或棕榈酸类似物代谢标记等方法评估棕榈酰化水平。热位移分析（差示扫描荧光法）通过监测蛋白质熔解温度的变化来测定化合物的结合情况。在HEK293T细胞中进行的YAP报告基因检测可量化YAP/TAZ-TEAD促进的基因转录的抑制情况。针对TEAD2、TEAD3和TEAD4的选择性分析证实了TEAD1的特异性。

基于细胞的TEAD棕榈酰化分析[1]
将Myc-TEAD表达质粒转染至HEK293T细胞，并用DMSO或100 μmol/L炔棕榈酸酯+DMSO/化合物处理20小时。用抗Myc抗体免疫沉淀Myc-TEAD蛋白，并进行点击化学反应。通过链霉亲和素免疫印迹法检测棕榈酰化的TEAD。酰基-PEG基交换凝胶迁移分析按先前所述进行。

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细胞增殖分析[1]
将细胞用不同浓度的化合物处理不同时间（起始浓度为3 μmol/L），然后使用CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒，按照制造商的方案进行检测。使用剂量反应曲线计算IC50和最大抑制率。

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免疫荧光[1]
细胞用4%多聚甲醛固定10至15分钟后，用0.1% Triton X-100的PBS溶液进行透化处理，然后在室温下用3% BSA的PBS溶液封闭1至2小时，4℃孵育过夜，再用Alexa Fluor标记的二抗在室温下孵育2至3小时。玻片用含DAPI的Prolong Gold抗淬灭剂封片。使用Nikon Eclipse Ti共聚焦显微镜采集图像。

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免疫沉淀[1]
细胞用PBS洗涤后，用裂解液裂解[50 mmol/L Tris pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% Triton-X100，50 mmol/L NaF，1 mmol/L PMSF，蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂]。超声处理和离心后，收集上清液，并与抗TEAD、抗YAP或对照抗体孵育，用Protein A/G琼脂糖珠沉淀，然后使用标准方案进行免疫印迹分析（抗体信息见补充表S3）。

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在NF2缺陷型间皮瘤细胞系（如NCI-H226和NCI-H2373）中进行了VT103 HCL的体外细胞实验。细胞用不同浓度的VT103 HCL处理4至24小时。通过共免疫沉淀或邻位连接分析评估YAP-TEAD1相互作用的破坏情况。测量TEAD1的棕榈酰化水平以确认靶点结合。使用标准细胞活力检测评估细胞增殖，以确定该化合物的抗增殖作用。通过qRT-PCR或RNA-seq分析基因表达变化，以评估下游转录效应。

动物/疾病模型： NCI-H226荷瘤小鼠[1]
剂量： 0.3~10 mg/kg
给药途径： 口服，每日一次
实验结果： 即使在0.3 mg/kg的剂量下也能抑制肿瘤生长。

小鼠药代动力学
将VT103盐酸盐、VT104和VT107配制成5% DMSO + 10% Solutol + 85% D5W溶液，分别以7或10 mg/kg的剂量进行静脉或口服给药。在指定时间点从隐静脉抽取血液。采用QTRAP 6500液相色谱-串联质谱法(LC/MS-MS)对化合物进行定量分析。数据分析采用Phoenix WinNonlin 6.3软件，静脉注射采用非房室模型201，口服采用非房室模型200。计算方法为线性/对数梯形法。

体内药效学和疗效研究
所有动物操作、护理和治疗程序均按照药明康德或Crown Bioscience, Inc.的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的指南进行，并遵循实验动物评估和认证协会(AAALAC)的指导。将受试药物配制成给药溶液（5% DMSO + 10% 索洛尔 + 85% 5%葡萄糖溶液；5%葡萄糖溶液=5%葡萄糖），每日按指定剂量口服给药。每周监测两次肿瘤体积和动物体重。

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使用NF2缺陷型间皮瘤细胞系的小鼠异种移植模型进行VT103 HCL的体内动物研究。荷瘤小鼠经口服给予不同剂量的VT103 HCL。在治疗期间，使用游标卡尺测量监测肿瘤生长情况。在研究终点，收集肿瘤组织进行药效学分析，包括评估TEAD1棕榈酰化、YAP/TAZ-TEAD靶基因表达和增殖标志物。药代动力学研究测量血浆和组织中的化合物浓度，以关联暴露量与疗效。

VT103 盐酸盐是 VT101 的类似物，具有更高的效力，并且在小鼠体内具有良好的口服药代动力学（图 2；补充表 S1）。VT104 是 VT102 的类似物，具有更高的效力，并且在小鼠体内具有良好的口服药代动力学（图 2；补充表 S1）。VT105 是 VT104 的更易溶的类似物（图 2），可用于 TEAD X 射线晶体学实验。VT106 和 VT107 是 VT104 的对映异构体；它们的效力差异很大，因此可作为生化和细胞实验中有用的交叉对照（图 2）。[1]

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VT103 盐酸盐具有优异的口服生物利用度和良好的药代动力学特性。口服给药后，该化合物可达到足以抑制 TEAD1 的治疗性血浆浓度。盐酸盐形式可提高水溶性，从而改善吸收。该化合物的药代动力学特征支持临床前研究中每日一次或两次给药方案。其代谢和消除途径与小分子抑制剂一致，主要通过肝脏清除。临床前动物模型已对包括Cmax、Tmax、AUC和半衰期在内的详细药代动力学参数进行了表征。

VT103 HCL 的毒理学数据主要来源于小鼠模型的临床前疗效研究。在有效剂量下，该化合物似乎总体耐受性良好，未报告严重不良反应。然而，临床开发需要开展全面的毒理学研究，包括啮齿类和非啮齿类动物的遗传毒性、安全性药理学和重复给药毒性研究。作为一种靶向 Hippo-YAP 通路的 TEAD1 抑制剂，鉴于该通路在发育和体内平衡中的作用，其潜在的靶向毒性可能包括对组织再生和器官大小调节的影响。

[1]. Small Molecule Inhibitors of TEAD Auto-palmitoylation Selectively Inhibit Proliferation and Tumor Growth of NF2-deficient Mesothelioma. Mol Cancer Ther. 2021;20(6):986-998.

神经纤维瘤病类型 2（NF2）基因突变限制或消除功能性梅林蛋白的表达，这种情况通常在恶性间皮瘤中出现。梅林蛋白激活 Hippo 信号通路，抑制 YAP 和 TAZ 的核转位。YAP 和 TAZ 是该通路中的关键效应因子，结合核 TEAD 转录因子，促进与细胞增殖和生存相关的基因表达。本文描述了我们发现的化合物，这些化合物选择性抑制 YAP/TAZ-TEAD 促进的基因转录，阻断 TEAD 自脂肪酰化，并破坏 YAP/TAZ 与 TEAD 之间的相互作用。优化筛选产生了具有优良口服生物利用度和药代动力学特性的高效类似物。这些类似物选择性抑制 NF2 缺失的间皮瘤细胞在体外的增殖以及在体内的皮下肿瘤异种移植的生长。这些高效且选择性的 TEAD 抑制剂为靶向 Hippo-YAP 通路提供了一种新方法。Hippo-YAP 通路以前难以药物化，但在恶性间皮瘤和其他 YAP 驱动的癌症及疾病中经常异常调节。[1] 除了验证化合物在小鼠中的耐受性外，本文所述的研究未涉及化合物的任何毒性，这可能与 TEAD 脂肪酰化抑制有关，也可能无关。需要在多种动物模型中进行正式的毒理学评估，以确定这些小分子化合物的安全性。如果结果令人满意，则有必要对 NF2 突变的间皮瘤和具有激活的 YAP/TAZ-TEAD 转录活性的癌症进行 TEAD 脂肪酰化抑制剂的临床评估，无论是单药治疗还是与其他靶向癌症疗法联合使用。[1]

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VT103 HCL 是一种研究化合物，靶向 TEAD1 蛋白自脂肪酰化，具有在 YAP 驱动的癌症（包括恶性间皮瘤）中的潜在应用。其机制涉及选择性抑制 TEAD1 脂肪酰化，阻断 YAP/TAZ-TEAD 媒介的基因转录。该化合物未获批准用于人类，仅供实验室研究。尚未报告临床试验。VT103 HCL 代表了一种靶向以前无法药物化的 Hippo-YAP 通路的新方法。

C18H17F3N4O2SHCI

446.87

C, 52.68; H, 4.18; F, 13.89; N, 13.65; O, 7.80; S, 7.81

2290608-13-6

VT-103; 2290608-13-6

137534047

Off-white to gray solid powder

3.1

84.4Ų

2

8

5

28

617

0

LCVDQHLYHBAHR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H17F3N4O2S/c1-22-28(26,27)14-7-8-16(15(9-14)17-10-25(2)11-23-17)24-13-5-3-12(4-6-13)18(19,20)21/h3-11,22,24H,1-2H3

N-methyl-3-(1-methyl-1H-imidazol-4-yl)-4-((4-(trifluoromethyl)phenyl)amino)benzenesulfonamide

VT-103 hydrochloride; VT 103; 2290608-13-6; N-Methyl-3-(1-methyl-1H-imidazol-4-yl)-4-((4-(trifluoromethyl)phenyl)amino)benzenesulfonamide; CHEMBL5198469; SCHEMBL20779435; LLCVDQHLYHBAHR-UHFFFAOYSA-N; QRD60813; VT103 hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO :>50mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: Formulation 1: ≥ 2.5 mg/mL (6.1 mM) in 10% DMSO + 90% Corn oil, 澄清溶液
例如，若需制备1 mL的工作液，取100 μL 25 mg/mL DMSO储备液，加入900 μL玉米油中，混匀（澄清溶液）。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。